Aplicación de la electroforesis en gel plano de policrilamida al microaislamiento de glicoformas de lipopolisacáridos con un nivel elevado de homogeneidad - Pupo Escalona, Elder (Editorial Universitaria, 2008)
En este trabajo de Tesis se investigó la aplicabilidad de las técnicas de electroforesis en el gel plano de poliacrilamida (slab-PAGE), tinción inversa, extrusión y elución pasiva como metodología para la purificación a escala preparativa de las especies individuales de las mezclas heterogéneas de lipopolisacáridos bacterianos (LPS).Primero se encontró que las glicoformas de LPS de mayor masa molecular se pueden recuperar, por difusión pasiva a escala analítica, en 1 por ciento (p/v) de SDS o DOC o en 5 por ciento (v/v) de trietilamina con una eficiencia de recuperación elevada (90-99 por ciento) y reproducible (CV [6 por ciento). Esto es independiente del tipo de LPS (rugoso, semirugoso, o liso) y del microorganismo de origen (p.ej., Vibrio cholerae O1, Serratia marcescens, Escherichia coli K-235 o E. coli O111:B4). En comparación con los detergentes, la solución de trietilamina permitió acortar de forma notable el tiempo de elución (3 h vs. menos de 10 min) de los LPS. A la escala preparativa, las especies individuales de LPS de tipo rugoso (p.ej., V. fischeri cepa HMK, Haemophilus influenzae cepa RM.118 [Rd ], - Pectinatus frisingensis VTT E-82164) o de tipo liso (p.ej., E. coli K-235) se obtuvieron con una pureza elevada (]90 por ciento) y sin ninguna modificación química apreciable. La eficiencia de recuperación fue menor (3.167.8 por ciento) que la mostrada a escala analítica y las cantidades obtenidas estuvieron en el intervalo de 280 ng a 410 g; estas dependieron de la abundancia relativa y el nivel de separación de las bandas de LPS.El análisis de las glicoformas micropurificadas de LPS de E. coli K-235 por el ensayo del lisado de amebocito de Limulus (LAL) verificó que el método de micropurificación preservó la actividad LALen el intervalo entre 4.4 0.5 y 20.2 1.1 unidades de endotoxina (UE)/pmol - de las especies de LPS. Ello fue independiente de la masa molecular (p.ej., 3.58-14.25 kDa), el tipo o la abundancia relativa (p.ej., 0.3-20.2 por ciento) del LPS.Estos resultados demuestran de forma definitiva la factibilidad del uso de las técnicas de slab-PAGE, tinción inversa, extrusión y elución pasiva, a escala preparativa, como tecnología de purificación para la obtención de glicoformas de LPS con un nivel elevado de homogeneidad.